Y-39983 HCl

Y-33075 dihydrochloride 是一种有效的 ROCK 抑制剂,源于 Y-27632,但活性更强,IC50 值 3.6 nM。

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信号通路 >> 干细胞及 Wnt 通路 >> 岩石

信号通路 >> TGF-beta/Smad 信号通路 >> 岩石

研究领域 >> 癌症

ROCK:3.6 nM (IC50)

PKC:420 nM (IC50)

CaMKII:810 nM (IC50)

Y-33075(Y-39983)是一种有效的ROCK抑制剂,IC50为3.6 nM。 Y-33075也比Y-27632更有效地抑制PKC和CaMKII,Y-27632和Y-33075对PKC的IC50分别为9.0μM和0.42μM,而Y-27632和Y-33075的IC50分别为CaMKII。分别为26μM和0.81μM。 Y-27632和Y-33075对PKC的IC50分别是ROCK的82和117倍,而Y-27632和Y-33075对于CaMKII的IC50分别是ROCK的236和225倍[1]。 Y-33075(Y-39983,10μM)延长视网膜神经节细胞(RGCs)中的神经突,与不用Y-39983处理的RGC相比[2]。 Y-33075(Y-39983,1μM)抑制组胺在无Ca2 +溶液中诱发的兔睫状动脉段的收缩。 Y-33075(10μM)对高钾(高钾)溶液[3]的[Ca2 +] i增加没有影响。

在兔中,Y-39983(≥0.01％)在局部给药后2小时显着降低眼内压(IOP)。在猴子中,Y-39983(0.05％)治疗的眼睛在局部给药后2至7小时内显示出IOP显着降低[1]。 Y-39983(100μM)增加大鼠眼中视网膜神经节细胞(RGCs)的再生轴突[2]。

在该测定中使用重组ROCK（ROKα/ ROCK II），纯化的蛋白激酶C（PKC：α，β，γ同种型的混合物）和重组钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMK II）。在室温下不存在或存在各种浓度的Y-27632，Y-33075或星形孢菌素的情况下，将ROCK（0.2 U / mL）与1μM[γ-32P] ATP和10μg/ mL组蛋白一起作为底物孵育20在含有0.1mg / mL牛血清白蛋白（BSA），5mM二硫苏糖醇[DTT]，10mMβ-甘油磷酸盐，50μMNa3VO4的20mM MOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）缓冲液（pH7.2）中分钟，和10mM MgCl 2，总体积为100μL。在不存在或存在各种浓度的Y-27632，Y-33075或星形孢菌素的情况下，将PKC（10ng / mL）与1μM[γ-32P] ATP和20μMPKC底物在室温下孵育30分钟。含有0.1 mg / mL BSA，10 mM DTT，10mMβ-甘油磷酸盐，50μMNa3VO4,2mMCaCl2,20μg/ mL磷脂酰-1-丝氨酸和10 mM MgCl2的mM MOPS缓冲液（pH 7.5），总体积100μL。在不存在或存在各种浓度的Y-27632，Y-33075或星形孢菌素的情况下，将CaMK II（125U / mL）与1μM[γ-32P] ATP，10μM钙调蛋白和20μMCaMKII底物一起温育。室温下在含有0.2 mg / mL BSA，0.5 mM DTT，0.1mMβ-甘油磷酸盐，50μMNa3VO4,1mM CaCl2和5 mM MgCl2的20 mM MOPS缓冲液（pH 7.5）中保持30分钟，总体积为100 μL。通过添加100μL的0.7％磷酸终止孵育。将160μL混合物部分转移至Multiscreen-PH板。带正电荷的磷酸纤维素滤膜吸收结合32P的底物。将过滤器用300μL的0.5％磷酸洗涤，然后用纯净水洗涤两次，然后干燥。用液体闪烁计数器测量干燥过滤器的放射性。结果表示为50％抑制浓度和95％置信区间（CIs）[1]。

简言之，通过木瓜蛋白酶处理从Wistar大鼠的解剖视网膜获得视网膜细胞悬浮液。视网膜神经节细胞（RGC）通过淘选方法使用抗大鼠CD11抗体纯化以去除小胶质细胞和抗大鼠Thy-1抗体以分离神经节细胞。将纯化的RGC（5000个细胞/板）接种到用50μg/ mL聚-L-赖氨酸和2μg/ mL merosin包被的24孔板中，并在补充有2％B27的无血清neurobasal培养基中培养。补充，50ng / mL BDNF，50ng / mL CNTF，5μM毛喉素和1mM谷氨酰胺，在95％空气-5％CO 2气氛下，37℃。在完成24小时培养后，将RGC在含有或不含10μMY-33075的培养基中培养24小时，并通过相差显微镜观察形态学。使用的浓度基于Y-33075对体外小梁网收缩的影响来确定。由于进行该研究是为了确认Y-33075是否具有对RGC轴突再生的潜在影响，因此无法对该效果进行无差异评价[2]。

简言之，SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（0.4 mg / kg体重）麻醉，一只眼的视神经在眼球后4至6 mm处横切，注意避免损伤眼动脉。切除坐骨神经的前支，并用尼龙缝合线自动缝合到视神经残端。将移植物的另一端缝合到颞肌。在完整动物的视神经横断后，将一小块（3mm×3mm）用10μMY-33075浸泡的明胶海绵或盐水作为对照植入光学残端后面的空间。将5μL0.12mM或1.2mM Y-33075溶液或盐水分别施用至玻璃体中至终浓度为10μM或100μM。使用的Y-33075的浓度确定为10μM，其在RGC的轴突再生的体外研究中有效，并且还为100μM以确认Y-33075的剂量响应。手术后6周，通过腹膜内注射戊巴比妥钠（0.4mg / kg体重）麻醉大鼠，并将4-Di-10ASP包埋在移植的坐骨神经中，逆行标记RGC，轴突再生进入坐骨神经。染料包埋三天后，对大鼠实施安乐死并摘出眼睛以制备视网膜扁平支架。然后将后眼杯与玻璃体分离，并在室温下用磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛溶液后固定约1小时。使用连接到计算机的荧光显微镜输入标记细胞的荧光显微照片。使用图像分析软件计数标记的细胞。作为正常组，用4-Di-10ASP逆行标记的后续程序在没有移植坐骨神经和给予试验药物的情况下进行。由于组间差异的不同，使用对数变换值进行统计分析。通过t检验（单独）和William检验（单侧）检查正常组和生理盐水组以及盐水和Y-33075组之间差异的统计学显着性。 p <0.05的结果被认为是显着的[2]。

[1]. Hideki Tokushige, et al. Effects of Topical Administration of Y-39983, a Selective Rho-Associated Protein Kinase Inhibitor, on Ocular Tissues in Rabbits and Monkeys Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. July 2007 vol. 48no. 7 3216-3222

[2]. Tokushige H, et al. Effects of Y-39983, a selective Rho-associated protein kinase inhibitor, on blood flow in optic nerve head in rabbits and axonal regeneration of retinal ganglion cells in rats. Curr Eye Res. 2011 Oct;36(10):964-70.

[3]. Watabe H, et al. Effects of Rho-associated protein kinase inhibitors Y-27632 and Y-39983 on isolated rabbit ciliary arteries.Jpn J Ophthalmol. 2011 Jul;55(4):411-7. Epub 2011 Jun 11.

Y-27632 2HCl | 盐酸法舒地尔 | 2-[3-[4-[(1H-吲唑-5-基)氨基]喹唑啉-2-基]苯氧基]-N-异丙基乙酰胺 | 水仙环素 | Thiazovivin | GSK429286A | GSK180736A | GSK269962A | SR3677 | Azaindole 1 | 盐酸瑞舒地尔 | 1-(3-羟基苄基)-3-[4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基]脲 | LX7101 | Chroman 1 | H-1152二盐酸盐