K-604二盐酸盐

K-604 dihydrochloride 是一种有效的选择性酰基辅酶 A：胆固醇酰基转移酶 1 (ACAT-1) 抑制剂,IC50 为 0.45±0.06 μM。

信号通路 >> 代谢酶/蛋白酶 >> 酰基转移酶

研究领域 >> 心血管疾病

ACAT-1:0.45 μM (IC50)

ACAT-2:102.85 μM (IC50)

检测K-604对人ACAT-1和ACAT-2的效力和选择性。 KAT 604对人ACAT-1的IC 50值为0.45μM,人ACAT-2的IC 50值为102.85μM,表明K-604对ACAT-1的选择性比ACAT-2高229倍。动力学分析表明该抑制对于油酰辅酶A具有竞争性,Ki值为0.378μM。 K-604有效抑制人巨噬细胞中的胆固醇酯化,IC50值为68 nM [1]。在无细胞生化测定中,0.5μM的K604抑制ACAT1酶活性达70％而不显着抑制ACAT2酶活性。为了研究阻断ACAT1是否增加神经元细胞中的自噬,用K604处理N2a细胞。结果显示,在0.1至1μM时,K604抑制ACAT活性60-80％。接下来,将K604以0.1至1μM的浓度添加至N2a细胞中24小时,并通过蛋白质印迹检查LC3水平。结果显示K604以剂量依赖性方式增加LC3-II/LC3-I比率,其是自噬体形成的可靠标记物。在K604处理后,N2a细胞中荧光LC3斑点的数量显着增加。通过蛋白质印迹,K604显着降低N2a细胞中p62的水平[2]。

使用F1B仓鼠,一种易受饮食诱导的高脂血症和动脉粥样硬化影响的动物模型,评估K-604对主动脉病变区域和血浆胆固醇水平的影响。施用K-604不影响体重或食物消耗。脂肪喂养仓鼠的血浆胆固醇水平比食物喂养的仓鼠高约12倍,只有在测试的最高剂量(30 mg/kg)时,K-604才显着降低血浆胆固醇水平,但在较低剂量时则不然(1高脂肪饮食显着诱导油红O的脂肪条纹病变染色,通过给予K-604显着降低。此外,进行动脉粥样硬化病变的组织学分析。对照组中的脂肪条纹病变的特征在于内皮下空间中泡沫巨噬细胞的积聚。相反,通过给予K-604 [1],泡沫巨噬细胞占据的面积显着减少。

通过测量胆固醇[14C]油酸酯的产生来确定ACAT活性。将来自CHO-ACAT-1或CHO-ACAT-2细胞的微粒体级分用CHAPS在0.5M KCl，0.5mM EDTA和25mM Tris-HCl（pH7.8）（缓冲液A）中稀释至最终蛋白质浓度为1.0。毫克/毫升。将含有9.2μgACAT-1蛋白质或4.9μgACAT-2的微粒体组分与10μL缓冲液A中的各种浓度的K-604（0.4,0.6和0.8μM）或CI-1011在5μL中混合。用含有1.6mM胆固醇，11.2mM磷脂酰胆碱和9.3mM牛磺胆酸盐的25.5mM EDTA和Tris-HCl（pH7.8）的152.5μL混合胶束重构DMSO。通过添加10μL的0.45μM[14 C]油酰基-CoA，10nM不含脂肪酸的牛血清白蛋白（不含脂肪酸的BSA）和25mM Tris-HCl（pH 7.8）开始反应。将反应混合物在37℃温育25分钟，并通过加入150μL氯仿/甲醇（2：1）终止反应混合物。有机相在氮气流下干燥。将脂质用150μL氯仿/甲醇（2：1）重悬浮，并使用己烷/乙醚/乙酸（75：25：1）通过薄层色谱（TLC）显色。使用BAS 2500图像分析仪[1]测定胆固醇[14C]油酸酯的放射活性。

将小鼠成神经细胞瘤细胞系N2a在含有10％胎牛血清（FBS）的DMEM / Opti-MEM（50:50）中于37℃，5％CO 2的湿润培养箱中培养。将细胞与ACAT1特异性抑制剂K604（0.1,0.5和1μM）或同种型非特异性ACAT抑制剂CI-1011一起温育24小时。在出生后第0-3天从小鼠脑中分离原代皮质神经元。将皮层神经元以350,000个细胞/孔接种在6孔板中，并在2mL /孔Neurobasal A中生长，其中含有1×B27,0.5mM L-谷氨酰胺和5ng / mL成纤维细胞生长因子。一半的媒体每7天更换一次新媒体。培养14-21天后，细胞用于个体实验[2]。

仓鼠[1] 8周龄的雄性F1B仓鼠（n = 30）用于动物实验。动物室控制在23±3℃，相对湿度为50±20％。给动物喂食CE-2饲料，然后补充含有0.3％胆固醇和10％椰子油的CE-2 10周。在脂肪负荷期间，K-604以1,3,10或30mg / kg /天口服给药（每个剂量组n = 6）。对照组（n = 6）接受0.5％甲基纤维素代替K-604的水溶液。随意给予自来水。在给药时测量体重。使用市售试剂盒（Cholesterol E-Test）对血液进行取样以测定血浆胆固醇水平。

[1]. Ikenoya M, et al. A selective ACAT-1 inhibitor, K-604, suppresses fatty streak lesions in fat-fed hamsters without affecting plasma cholesterol levels. Atherosclerosis. 2007 Apr;191(2):290-7.

[2]. Shibuya Y, et al. Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1 blockage enhances autophagy in the neurons of triple transgenic Alzheimer's disease mouse and reduces human P301L-tau content at the presymptomatic stage. Neurobiol Aging. 2015 Jul;36(7):2248-2259.

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