PU-WS13

PU-WS13 是一种选择性的 Grp94 抑制剂,EC50 值为 0.22 μM。

信号通路 >> 细胞周期/DNA损伤 >> HSP

信号通路 >> 代谢酶/蛋白酶 >> HSP

研究领域 >> 癌症

GRP94:0.22 μM (EC50)

HSP90α:27.3 μM (EC50)

HSP90β:41.8 μM (EC50)

TRAP-1:7.3 μM (EC50)

PU-WS13是Grp94抑制剂,EC50为0.22μM。 PU-WS13还略微抑制Hsp90α,Hsp90β和Trap-1,EC50分别为27.3,41.8和7.3μM。 PU-WS13(2.5-20μM)对两种非恶性细胞系没有毒性。 PU-WS13(15μM)破坏了通过Grp94介导的SKBr3细胞质膜上HER2的环状结构。 PU-WS13抑制Grp94,并且该抑制诱导HER2过表达乳腺癌细胞的凋亡并降低其活力[1]。

Hsp90 FP竞争测定在黑色96孔微板中进行，每孔的总体积为100μL。在DMSO中制备10μMcy3B-GM和PU-FITC3的原液，并用Felts缓冲液（20mM Hepes（K），pH7.3,50mM KCl，2mM DTT，5mM MgCl2,20mM Na2MoO4和0.01％稀释）。 NP40含0.1 mg / mL BGG）。向每个孔中加入荧光染料标记的Hsp90配体（6nM cy3B-GM用于Hsp90α，Hsp90β和Grp94和3nM PU-FITC3用于Trap-1），蛋白质（10nMHsp90α，10nMHsp90β，10nM Grp94， 30nM Trap-1）和测试的抑制剂（包括PU-WS13，DMSO中的初始原液），终体积为100μLFelts缓冲液。化合物一式两份或一式三份加入。对于每个测定，在每个测定板上包括背景孔（仅缓冲液），示踪物对照（仅游离的，荧光染料标记的Hsp90配体）和结合的对照（在蛋白质存在下的荧光染料标记的Hsp90配体）。将测定板在振荡器上于4℃温育24小时，并测量FP值（以mP计）。与Hsp90结合的荧光染料标记的Hsp90配体的分数与mP值相关并且相对于竞争剂浓度的值作图。通过拟合数据获得50％结合的荧光染料标记的Hsp90配体被置换的抑制剂浓度。对于cy3B-GM，使用530nm的激发滤光器和580nm的发射滤光器，其具有561nm的二向色镜。对于PU-FITC3，使用485nm的激发滤光器和530nm的发射滤光器，其具有505nm的二向色镜。分析所有实验数据，并给出结合亲和力值作为相对结合亲和力值（EC50，50％荧光配体被化合物竞争的浓度）[1]。

用抑制剂（包括PU-WS13）处理细胞72小时或用Grp94 siRNA或对照siRNA转染细胞，并使用CellTiter-Glo发光细胞存活力测定评估它们的存活力。该方法基于存在的ATP的量化来确定培养物中存活细胞的数量，其表明存在代谢活性细胞[1]。

[1]. Patel PD, et al. Paralog-selective Hsp90 inhibitors define tumor-specific regulation of HER2. Nat Chem Biol. 2013 Nov;9(11):677-684.

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